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                iTRAQ/TMT標簽結構以及相對定量原理詳解

                品牌名稱: 百泰派克生物科技
                業務范圍: 技術服務
                經營模式: 生產廠商
                單價: 面議
                發貨期限: 自買家付款之日起 天內發貨
                所在地: 河北 保定
                有效期至: 長期有效
                發布時間: 2023-12-21 04:41
                最后更新: 2023-12-21 04:41
                瀏覽次數: 243
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                導讀

                ? iTRAQ/TMT定量蛋白組學技術

                ? iTRAQ/TMT標簽分子組成

                ? iTRAQ/TMT技術原理

                iTRAQ和TMT標簽介紹

                說到iTRAQ和TMT很多人可能會以為這是兩中不同的定量組學技術,但其實呢,iTRAQ和TMT技術只是生產商不同,除了標記規格和標簽分子結構有些許差異,標記肽段的原理基本上是一樣的。其中iTRAQ由AB SCIEX所開發,緊接著Thermo Fisher研發了TMT,二者只是專利不同,使用原理基本一致。

                iTRA Tag for Relative anduantitation

                TMT:Tandem Mass Tag


                iTRAQ-TMT標簽結構以及相對定量原理詳解-百泰派克生物

                iTRAQ和TMT標記實質上就是一種化學體外標記試劑,能夠特異性標記蛋白質酶解產生的多肽。iTRAQ和TMT標記的蛋白樣品規格不同,TMT能夠標記更廣泛的樣品數,能夠定量分析多組蛋白樣品,少至2個蛋白樣品,多至10個蛋白樣品,TMT蛋白定量都能夠做到。通過標記多組不同樣品,TMT和iTRAQ能夠比對正常組織樣品和腫瘤組織樣品的蛋白水平差異,以及精準檢測腫瘤在發展的不同階段的蛋白水平變化。

                iTRAQ和TMT的標記原理一樣,兩種標簽的結構卻有一些差異,我們來看看ITRAQ和TMT的標簽結構一個各自的細微差異吧

                iTRAQ與TMT的分子結構比較


                iTRAQ與TMT的分子結構比較

                從上圖來說,我們可以看到iTRAQ和TMT標簽在結構上有著明顯的差異,也有著一些共同點,兩個標簽都由報告基團,平衡基團以及肽反應基團組成,兩個標簽的各自報告基團和平衡基團的總重都是一定的。兩個標簽的肽反應基結構也是一樣的。iTRAQ和TMT標簽的差異在于平衡基團的結構,從下圖可以看到TMT的平衡基團結構比iTRAQ標簽的更為復雜。iTRAQ標簽的平衡基團只有幾十Da,而TMT的平衡基團接近200Da,這也是造成iTRAQ和TMT標簽質量差異的原因。

                簡單介紹完兩個標簽的結構后,我們再以iTRA標簽為例,詳細認識一下iTRAQ分子標簽的結構組成

                iTRAQ分子結構組成


                iTRA標簽結構

                iTRAQ標簽分子骨架由三部分核心組件構成:報告基團,平衡基團和肽反應基團。其中,報告基團和平衡基團構成等基團。不同的iTRAQ標簽的報告基團的重量不同,4-plex標簽的報告基團重量分別是:114,115,116,117Da;平衡基團的質量分別是:31,30,29,28Da,使得4個iTRAQ標簽的報告基團總重都是145Da。一個核心組件就是肽反應基團,其主要的功能就是與多肽游離的N端氨基發生置換反應,使同位素標簽共價交連到肽段N端。

                前面說到標簽報告基團和平衡基團的質量,很多人可能會好奇,標簽的報告基團僅僅相差幾個Da,這是如何做到的呢?其實這就是利用了同位素標記的原理。下面我們以iTRAQ標簽為例進行解釋。

                如下圖,質量為114的報告基團包含1個C13,報告基團質量增加1Da。平衡基團包含1個C13和1個O18,質量總共增加3Da,114標簽的總質量增加4Da。以此類推,115的報告基團增加2Da,平衡基團增加2Da;116的報告基團增加3Da,平衡基團增加1Da;117的報告基團增加4Da,平衡基團增加0Da。以上四個標簽通過對報告基團和平衡基團進行不同的同位素標記后,各自的報告基團和平衡基團的增加質量不同,增加的總的質量是一樣的,標簽的總重相等。


                iTRAQ標簽的同位素標記

                標簽與肽段反應的過程


                肽段標記反應過程

                iTRAQ相對定量研究原理

                蛋白質被裂解為肽段,用iTRAQ試劑進行差異標記。由于iTRAQ試劑是等量的,即不同同位素在標記同一多肽后在第一級質譜檢測,分子量完全相同,用串聯質譜方法對在第一級質譜檢測到前體離子進行碰撞誘導解離,產物離子通過第二級質譜進行分析。在二級質譜分析過程中,報告基團、質量平衡基團和多肽反應基團之間的鍵斷裂,質量平衡基團丟失,產生低質荷比(m/z)的報告離子。由于二級質譜可分析相對分子質量相差1的報告基團,不同報告基團離子強度的差異就代表了它所標記的多肽的相對豐度。多肽內的酰胺鍵斷裂,形成一系列 b 離子和 y 離子,得到離子片段的質量數,通過數據庫查詢和比較,可以鑒定出相應的蛋白質前體。


                iTRAQ定量分析原理

                iTRAQ相對定量研究流程


                iTRAQ定量分析流程

                1-. 對不同的蛋白質樣品進行酶切消化成多肽片段

                2. 使用不同的iTRAQ標簽對不同蛋白樣品消化產生的多肽片段分別進行標記,不同的iTRAQ標簽的總質量是一樣的。

                3. 比例混合各個標記后的樣品

                4. 帶上標記的多肽片段經過一級質譜分離,在一級質譜中,iTRAQ標簽由于總質量數一樣,來自不同蛋白樣品的相同肽段不能被區分,會一起進入二級質譜分析

                5. 在二級質譜中,在高能碰撞下iTRAQ的平衡基團會被打碎,報告基團得到釋放,肽段也被釋放,碰撞碎裂成二級碎片。這時通過分析肽段的氨基酸序列,可以推測對應的蛋白質的序列;各個報告基團的在質譜中的信號強度代表多肽在4組樣品中的相對豐度,即反應相應的蛋白質在4組樣品中的相對表達水平。


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                北京百泰派克生物科技有限公司(Beijing Bio-Tech Pack Technology Company Ltd. 簡稱BTP)從事以生物質譜為依托的生物藥物表征,大分子物質(包括蛋白質、多肽、代謝物)質譜分析以及小分子物質檢測服務。公司采用ISO9001質量控制體系,專業提供以質譜為基礎的CRO檢測分析服務,業務范圍覆蓋蛋白質組學、多肽組學、代謝組學、生物藥物表征、單細胞分析、單細胞質譜流式、生信云分析以及多組學生物質譜整合分析等。7大質量控制檢測平臺,服務3000+企業,10000+客戶的選擇,致力于為您提供y_ō_u|z_h_ì的生物質譜分析服務!



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